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クロマチン解析




エピゲノム解析導入



ヒストン修飾


1. ChIP-Seq

説明

  • Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled with high-throughput sequencingの略
  • 各ヒストン修飾やヒストンバリアント特異的抗体を使用。
  • ヒストンコード仮説:「ヒストンは4種類のタンパク質(H2A, H2B, H3, H4)が2つずつ組み合わさって、八量体を形成している。個々のタンパク質ではさまざまな修飾(メチル化、アセチル化など)や変異体置換(H2AZ, H3.3など)を起こることが知られており、これらの修飾反応が遺伝子発現や複製などの細胞内プロセスの制御をしている」というD. Allisらが提唱した仮説
  • 近年は再生医学(幹細胞)や免疫(T細胞など)の分野で特に盛んに行われている。

応用

Dry解析例

- ユニークにマップされたリードを使ったピーク同定。
- ピーク同定はヒストン修飾の種類によって注意が必要。(H3K4me3などはsharpなピークを示すことが多いが、H3K36me3などはピークがboradで、通常デフォルト値でピーク同定プログラムを走らせると十分なピークが得られない場合が多い。)
- ヒストン修飾用ピーク同定プログラムもある。
  1. CCAT(external link)
  2. SICER(external link)

関連論文(ヒストンコード報告例)

1. ヒストンバリアント

種類テロメア・セントロメアエンハンサー・リプレッサープロモーター・転写開始点遺伝子領域
H2A.ZR(external link)A(external link),A-R(external link)A(external link),A-R(external link)
H3.2 R(external link)
H3.1R(external link)
H3.3 A(external link)A(external link), A-R(external link)A(external link)


2. ヒストンメチル化

種類テロメア・セントロメアエンハンサー・リプレッサープロモーター・転写開始点遺伝子領域
H2BK5me1 A(external link)A(external link)
H3K27me1 A(external link)A(external link)
H3K27me2 R(external link)
H3K27me3 R(external link)R(external link)R(external link)
H3K36me3 A (in exon)(external link)
H3K4me1 A(external link)A(TSSからme3->me2->me1)(external link)A(TSSからme3->me2->me1)(external link)
H3K4me2 A(external link)A(TSSからme3->me2->me1)(external link)A(TSSからme3->me2->me1)(external link)
H3K4me3 A(external link)A(TSSからme3->me2->me1)(external link)A(TSSからme3->me2->me1)(external link)
H3K79me1 A(external link) A(external link)
H3K79me2R(external link) A(external link)
H3K79me3 A-R(external link)
H3K9me1 A(external link)A(external link)
H3K9me2 R(DNA methyl)(external link)
H3K9me3R(Repeat)(external link) R(DNA methyl)(external link)
H3R2me1
H3R2me2 R(3'-side)(external link)
H4K20me1 A(external link)A(external link)
H4K20me3R(Repeat)(external link)
H4R3me2 A(external link)

3. ヒストンアセチル化

種類テロメア・セントロメアエンハンサー・リプレッサープロモーター・転写開始点遺伝子領域
H2BK5ac A(external link)
H3K27ac A(external link)A(external link)


☆記述の意味
  • A: Active genes
  • R: Repressive genes
  • A-R: Both (active and repressive)
☆参考文献はひとつのみ引用(その他にも多くの報告がある場合が多い)

参考

  1. SEQanswers(external link)


クロマチン構造


方法 長所 短所
MNase-Seq個々のヌクレオソームの位置を見ることができる他の方法に比べ、多くの配列数が必要。また酵素の配列依存性(AT-richを切りやすい)の影響を受ける(Albert et al. 2007(external link))。
FAIRE-Seq酵素の配列依存性の影響を受けにくい個々のヌクレオソーム位置は解析できない。
DNase-SeqMNaseに比べ酵素の配列依存性は低い(Crawford et al. 2006(external link)) 個々のヌクレオソーム位置は解析できない。


1. MNase-Seq

説明

  • Micrococcal nuclease digestion coupled with high-throughput sequencingの略
  • MAINE-Seq(MNase-assisted isolation of nucleosomes)とも呼ばれる (Ponts et al. 2010(external link))。
  • カルシウム依存性エンドヌクレアーゼMicrococcal nuclease(MNase)を使用。
  • 本酵素はリンカー領域において二本鎖切断を起こすが、ヌクレオソーム領域では一本鎖ニックしか起こさない。つまりヌクレオソーム結合DNAはMNaseによる切断を受けない。
  • 本酵素により切断した真核生物ゲノムDNAをagaroseゲル電気泳動にかけるとモノヌクレオソームサイズ(約147bp)とその倍数のサイズに相当するバンドが得られる。
  • 本性質を使って得られたモノヌクレオソームDNAを次世代シーケンサにてシーケンシング。

応用

  1. ヌクレオソーム結合領域の同定。
  2. ヒストン-DNA相互作用(ヌクレオソームポジショニングの配列依存性解析)。
  3. 外部または内部環境変化によるヌクレオソーム構造変化(ヌクレオソームリモデリング)の解析。

Dry解析例(Albert et al. 2007(external link))

  1. ユニークにマップされたリードの5'端から73bpシフトさせた位置をヌクレオソームのpotential centerとする。
  2. Potential centerは重み平均(重みは標準偏差20のガウス分布)でスムージング

関連論文(2011.01.13)

生物種 学名 条件 プラットフォーム 参考
ヒト Homo Sapiens CD4+T細胞(Resting, Activated) Illumina Schones et al. 2008(external link)
ヒト Homo Sapiens DLD1細胞 Illumina Sathria et al. 2010(external link)
ヒト Homo Sapiens HeLa細胞 Illumina Auerbatch et al. 2009(external link)
ヒト Homo Sapiens Sperm Illumina Hammoud et al. 2009(external link)
マウス Mus musculus Liver Illumina Changolkar et al. 2009(external link)
マウス Mus musculus PUER細胞(タモキシフィン処理) Illumina Heinz et al. 2010(external link)
メダカ Oryzias latipes Hd-rR胞胚 Illumina Sasaki et al. 2009(external link)
ショウジョウバエ Drosophila melanogaster S2細胞(Untreated, Mock-treated and NELF-depleted) Illumina Gilchrist et al. 2010(external link)
線虫 Caenorhabditis elegans WT(N2) and zim-2 mutant Illumina Gu et al. 2010(external link)
線虫 Caenorhabditis elegans WT(N2) SOLiD Valouev et al. 2008(external link)
アスペルギルス-フミガーツフ Aspergillus fumigatus Af293 strain Illumina Nishida et al. 2009(external link)
熱帯熱マラリア原虫 Plasmodium falciparum 3D7 strain (sorbitol treatment) Illumina Ponts et al. 2010(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain (10uL and 15uL MNase) Illumina Weiner et al. 2010(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae S288C strain (normal and heat-shocked cells) Illumina Shivaswamy et al. 2008(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4741 strain 454 Mavrich et al. 2008(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae Sigma1278b L5366 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4743 strain Illumina Tirosh et al. 2010(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae WT(W303) and mutant (MdVy200, orc1-161) Illumina Eaton et al. 2010(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae BY4741 (YPD, Ethanol-rich, Galactose-rich, in vitro reconstitute) Illumina Kaplan et al. 2009(external link)
酵母 Saccharomyces mikatae IFO1815 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
ビール酵母 Saccharomyces bayanus NRRL Y-11845 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
酵母 Saccharomyces castellii NRRL Y-12630 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
酵母 Saccharomyces paradoxus NRRL Y-17217 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
酵母 Saccharomyces paradoxus CBS 432 honat MATα strain Illumina Tirosh et al. 2010(external link)
ハイブリッド酵母 Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces paradoxus BY4741 X CBS432 honat MATα strain Illumina Tirosh et al. 2010(external link)
酵母 Saccharomyces kluyveryii NRRL 12651 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
酵母 Kluyveromyces waltii NCYC 2644 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
キラー酵母 Kluyveromyces lactis CLIB 209 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
酵母 Candida glabrata CLIB 138 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
カンジダ菌 Candida albicans SC 5314 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
カンジダ菌 Candida albicans SC 5314 strain (in vivo and in vitro reconstitute) Illumina Field et al. 2009(external link)
酵母 Debaryomyces hansenii NCYC 2572 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
アルカン資化酵母 Yarrowia lipolytica CLIB 89 strain Illumina Tsankov et al. 2010(external link)
シロイヌナズナ Arabidopsis thaliana Columbia-0 strain (shoots) Illumina Chodavarapu et al. 2010(external link)


参考

  1. Nature Methods - 2, 719 - 720 (2005) (external link)
  2. Nature Glossary terms(external link)


2. FAIRE-Seq

説明

  • Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements coupled with high-throughput sequencingの略
  • ホルムアルデヒドによりヒストン-DNA間に架橋を形成。フェノール・クロロフォルムにより架橋を形成していないDNAを抽出。
  • 本サンプルを次世代シーケンサでシーケンシングすることでヒストンタンパク質と結合していないゲノムDNA配列が得られる。

応用

  • オープンクロマチン領域の同定
  • 活性化転写制御エレメントの同定

Dry解析例(Gaulton et al. 2010(external link))

  1. ユニークにマップされたリードの5'端からDNAフラグメントの長さ分伸ばす(例:200bp)。配列全体がオープンクロマチン領域という認識?
  2. ゲノム上の各位置ごとにRead density(リード数のカウント)を計算。
  3. ピーク同定プログラムでオープンクロマチン領域の同定。ピーク幅は1000bpくらい。

関連論文(2011.01.13)

生物種 学名 条件 プラットフォーム 参考
ヒト Homo sapiens MCF7細胞(E2-treated and -untreated) Illumina Joseph et al. 2010(external link)
ヒト Homo sapiens H9 ESC細胞 Illumina Rada-Iglesias et al. 2010(external link)
ヒト Homo sapiens 膵臓ランゲルハンス島 Illumina Gaulton et al. 2010(external link)
熱帯熱マラリア原虫 Plasmodium falciparum 3D7 strain (sorbitol treatment) Illumina Ponts et al. 2010(external link)

参考

  1. euchromatin.com(external link)
  2. Gaulton et al. 2010(external link)


3. DNase-Seq

説明

  • Deoxyribonuclease I digestion coupled with high-throughput sequencingの略
  • エンドヌクレアーゼDeoxyribonuclease I(DNase I)のクロマチンの緩い領域を切断しやすい性質を利用。

応用

  • オープンクロマチン領域の同定。DNaseI hypersensitive site (DNase HS)と呼ばれている。
  • 活性化転写制御エレメントの同定。

Dry解析例Crawford et al. 2006(external link)

  1. ユニークにマップされたリードの5'端の位置を利用。5'端(DNaseIにより切断された位置)がオープンクロマチン領域という認識
  2. ウィンドウをスライドさせてリード数の多い領域をDNase HSとして同定。

関連論文(2011.01.13)

生物種 学名 条件 プラットフォーム 参考
ヒト Homo sapiens リンパ芽球様細胞 Illumina McDaniell et al. 2010(external link)
ヒト Homo sapiens 膵臓ランゲルハンス島 Illumina Stitzel et al. 2010(external link)
ヒト Homo sapiens CD4+ T細胞 Illumina, 454 Boyle et al. 2008(external link)
マウス Mus musculus liver(成長ホルモン処理・非処理) Illumina Ling et al. 2010(external link)
出芽酵母 Saccharomyces cerevisiae R276 strain Illumina Hesselberth et al. 2009(external link)

参考

Duke DNase protocol(external link)


質問やアドバイスなど

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